Технологии и оборудование, применяемые при культивировании клеток из тканей человека

Для исключения микробиологического и механического загрязнения все работы с биоматериалом ведутся в стерильных условиях. С этой целью используются ламинарные укрытия (защита продукта) либо боксы биологической безопасности (защита продукта, оператора и окружающей среды). Современное высокотехнологичное оборудование данного предназначения производит российская компания «Ламинарные системы».

Ламинарный бокс с вертикальным нисходящим потоком воздуха предназначен для создания беспылевой абактериальной среды

Клеточные культуры обычно выделяют из эмбриональных тканей. Связано это с тем, что изолированные эмбриональные клетки лучше выживают, активнее растут и отличаются более низким уровнем специализации по сравнению с клетками взрослых тканей. Культивирование осуществляется в два этапа. На первом из них получают так называемые первично-трипсинизированные культуры. С этой целью последовательно выполняют ряд операций.

Изоляция и измельчение (механическая дезагрегация) фрагмента ткани с последующим отмыванием и обеззараживанием эксплантов

Если стоит задача получения культуры клеток из жировой ткани, образец рекомендуется извлекать непосредственно при препарировании.

При измельчении образца из ткани любого типа важно пользоваться максимально острыми инструментами для уменьшения процента поврежденных клеток.

Отмывание и обеззараживание готовых эксплантов производится с помощью используется раствор Хенкса, в который добавляют антибиотики.

Ферментативная дезагрегация

В некоторых случаях клетки способны самостоятельно мигрировать из эксплантов, но чаще требуется их освобождение с помощью ферментов. Выбор ферментов зависит от типа ткани. Для этих целей могут быть использованы как препараты грубой очистки (неочищенные), так и очищенные.

Неочищенные ферменты действуют более эффективно за счет присутствия примесей других протеаз. Очищенные препараты используют тогда, когда необходимо их специфическое действие либо требуется уменьшить токсичность среды для ферментации.

Наиболее эффективно работают, но, в то же время, часто повреждают клетки проназа и трипсин. Наиболее мягким действием обладают диспаза и коллагеназа, однако дезагрегация этими препаратами зачастую бывает неполной.

Трехместная магнитная мешалка с подогревом

Различные ферменты могут применяться как изолировано, так и в комплексе. Выбор конкретных препаратов зависит от особенностей получаемых клеток и тканей. Так, например, для разрушения межклеточного матрикса в хрящевых тканях используют трипсин либо гиалуронидазу и коллагеназу. Для удаления высвобожденной из лизированных клеток ДНК, которая мешает дезагрегации и способствует реагрегации, в среду для ферментации добавляют ДНКазу.

Обработка трипсином проводится при комнатной или повышенной до 37C температуре. Увеличить интенсивность разрушения межклеточных перегородок позволяет использование специальных смесителей или электромагнитных мешалок, которые могут быть одноместными и многоместными, с подогревом и без подогрева. Весь процесс занимает от 10 до 30 минут.

Центрифугирование клеточной суспензии

Полученную после дезагрегации суспензию фильтруют для освобождения от крупных фрагментов и тканевых волокон, а затем подвергают мягкому кратковременному центрифугированию. Скорость вращения ротора устанавливается в диапазоне от 800 до 1000 об/мин, конкретные значения выбираются с учетом типа обрабатываемого материала.

В линейку центрифуг для лабораторий производства британской компании входят приборы исследовательского класса, способные работать в широком диапазоне скоростей и обеспечивающие возможность оптимизации режима центрифугирования под конкретные задачи, в том числе – для фракционирования клеточной суспензии без повреждения компонентов.

Исследовательская центрифуга К1015 может быть использована для мягкого центрифугирования

К таким аппаратам, в частности, относятся исследовательские микроцентрифуги K 1015, наделенные: функцией автоматического распознавания модели ротора, возможностью выбора оптимального режима разгона и торможения из 10 предустановленных, поддержкой гибкой регулировки скорости с шагом 1 об/мин. 108 ячеек памяти прибора позволяют хранить соответствующие количество режимов центрифугирования, что особенно удобно при широком спектре решаемых задач.

Ресуспендирование и перенос в матрацы

После центрифугирования надосадочная жидкость сливается, а образовавшийся осадок вновь промывается раствором Хенкса.

Готовые среды для выращивания клеточных культур

К отмытым клеткам добавляется питательная среда с тем расчетом, чтобы их концентрация в 1 мл достигала от 100 до 400 тысяч. Следует отметить, что концентрация клеток в первичных культурах всегда должна быть высокой, так как значительная часть их погибает. Лучшие результаты получаются при использовании богатых питательных сред (Хэма f12 и др.) или ФБС. Простые среды, телячьи и лошадиные сыворотки работают хуже. Разлитую в культуральные сосуды суспензию плотно закрывают пробками, взвесь термостатируют при температуре 37 °С.

Приготовление монослойной культуры

Клетки большинства нормальных тканей способны к выживанию и пролиферации лишь в том случае, если они смогут закрепиться на подходящем субстрате. Такие субстраты наносятся на стенки культуральных сосудов. Закрепившиеся на субстрате клетки, в среднем, в течение недели образуют плотный монослой. Его наличие, а также изменение цвета красителя-индикатора, свидетельствуют о том, что первичная культура готова, и ее пора рассеивать.

Пересев клеток

Для начала клетки необходимо отделить от поверхности субстрата. С этой целью из культурального сосуда удаляют ростовую среду, заменяя ее раствором трипсина, подогретым до температуры тела (35-37°C).

Через 3-5 минут трипсин сливают и дожидаются, когда набухшие клетки полностью отделятся от матрицы. Затем в сосуд добавляется свежая питательная среда. Часть взвеси (четверть либо половина) переносится в новый сосуд. Данная процедура называется пассированием. Ее можно повторять несколько раз (до 50-ти пассажей включительно) без изменений структуры и свойств клеток.

При этом формируются клеточные культуры ограниченного роста, которые сохраняют способность к делению в течение различного периода времени. К таким клеточным линиям, в том числе, относятся диплоидные штаммы, обычно используемые для приготовления вакцин.

Каждый диплоидный штамм выдерживает несколько десятков пересевов, однако максимальная активность пролиферации наблюдается, начиная от 5-го и заканчивая 20-м пассажем.

Шейкер-инкубатор SI500 с принудительной циркуляцией воздушных потоков

После определенного количества пассажей диплоидные штаммы дегенерируют либо превращаются в постоянную клеточную линию, изменяя свои ростовые свойства. При этом в культуре возрастает число гетероплоидных клеток.

Культивирование опухолевых клеток с получение суспензионных клеточных линий

В отличие от клеток здоровой ткани, клетки опухоли часто способны к пролиферации непосредственно в жидкой среде с получением клеточной линии в виде суспензии. Такие клеточные линии получают, встряхивая образец с частотой 100-200 об/мин. Для этих целей идеально приспособлены шейкеры-инкубаторы марки Stuart.

Вернуться к списку