Рациональные подходы к молекулярной биологии. Часть 1: Выделение общей ДНК

Правильно выстроив работу лаборатории молекулярной биологии, можно в разы увеличить ее производительность, повысить безопасность персонала, обеспечить надлежащее качество биоматериала и минимизировать затраты.

Прибор для электрофореза «КАПЕЛЬ®-104T» с автосамплером и УФ-спектрофотометрической детекцией позволяет проводить анализ в автоматическом режиме

Как правило, решение поставленной задачи начинается с выделения общей ДНК из клеточного материала. Вслед за этим производится приготовление векторной ДНК, которую анализируют методом электрофореза и обрабатывают рестриктазами. Затем из векторной ДНК в бактериальной культуре клонируется нужный ген, после чего из клеток-редуцентов выделяется рекомбинантный белок.

Его также исследуют с помощью электрофоретического анализа, определяют концентрацию и, при необходимости, подвергают дополнительной очистке.

На каждом из этих этапов применяются различные методы, реагенты и оборудование.

Выделение общей ДНК из клеточной культуры

Данная методика в большинстве случаев является базовым этапом при исследовании живого организма на молекулярном уровне, так как все происходящие в клетках процессы катаболизма и биосинтеза напрямую или опосредованно контролируются ДНК. Выделение общей ДНК происходит в 2 этапа.

Этап 1. Лизис (разрушение) клеток и очистка хромосомной ДНК

Для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты из ядерного содержимого и органелл клетку необходимо разрушить. Очистка молекул хромосомной ДНК, прежде всего, производится с целью удаления связанных с ними белков нуклеопротеидного комплекса путем денатурации последних.

Такая обработка должна проводиться грамотно, в противном случае нуклеазы фрагментируют длинные молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Для лизиса и денатурации часто пользуются смесью фенола и хлороформа в соотношении 1:1

К наиболее распространенным методам лизиса клеток и разрушения белков относится обработка клеточной культуры гуанидинизотиоцианатом (GTC) или додецилсульфатом натрия (SDS). В зависимости от типа обрабатываемого материала, также можно пользоваться лаурилсульфатом (SLS), натрий-саркозином (NDC) и другими детергентами. «Золотой стандарт» экстракции ДНК – простой и надежный фенол-хлороформный метод. К минусам данной методики относится необходимость работы с высокотоксичными веществами, что требует неукоснительного соблюдения мер предосторожности, в том числе: осуществления манипуляций в вытяжных шкафах и ламинарных укрытиях, полного исключения контакта с кожей, использования микро-количеств смеси фенол-хлороформ.

Современные методы выделения клеточной ДНК могут включать этап ее адсорбирования на силикагелевых гранулах с последующим центрифугированием и извлечением осажденной на силикагеле ДНК в раствор. Для осаждения ДНК на силикагелевые гранулы требуются хоатропные вещества.

Выделить ДНК также можно с помощью готовых коммерческих наборов реактивов, в состав которых входят покрытые диоксидом кремния магнитные частицы. Использование некоторых готовых наборов реактивов позволяет адсорбировать молекулы ДНК на ионообменных сорбентах либо мембранах.

Этап 2. Центрифугирование субстрата после лизиса и оценка качества выделенной ДНК

Для удаления из образцов фрагментов клеточных органелл и денатурированных белков отлично приспособлены центрифуги Centurion Scientific, работающие в нужном диапазоне скоростей.

Под этой маркой выпускаются универсальные гибко настраиваемые аппараты исследовательского класса серии Pro-Research с расширенными возможностями, опционально оснащаемые низкоскоростными и высокоскоростными роторами.

Настольная лабораторная центрифуга PrO-Hospital LLR идеально подойдет для получения ДНК из клеточных субстратов

Однако если методику планируется поставить на поток, сведя ее себестоимость к разумному минимуму, можно вполне обойтись более простой и дешевой центрифугой для клинических исследований с подходящим функционалом. В данном случае обращайте внимание на аппараты серии PrO-Hospital – PCVS, HL, HLR, LC, LL и LLR. Они поддерживают работу в требуемом скоростном диапазоне и комплектуются подходящими роторами.

Такие же приборы, как, например, низкоскоростная центрифуга для получения плазмы крови серии Pro-PRP или цитоцентрифуга серии Pro-CYT относятся к узкоспециализированным устройствам и предназначены для решения принципиально иных задач.

Конструктивные особенности настольных центрифуг Centurion Scientific обеспечивают гарантированную стабильность температуры по всему объему центрифужной камеры, а также точное соответствие установленных параметров скорости, разгона и торможения. Это позволяет избежать порчи редких образцов, сводит к нулю риск ошибок при дальнейшем анализе и способствует подготовке качественного биоматериала для клонирования генов.

После выделения общей ДНК, ее осаждают из раствора с помощью 70% этилового спирта. Такая обработка позволяет полностью избавиться от других органических соединений и низкомолекулярных веществ, остающихся в растворе. В спиртовом растворе ДНК может храниться в течение длительного времени (в холодильнике), поэтому на данном этапе в работе можно сделать перерыв.

Обработанные спиртом образцы вновь подвергаются центрифугированию. Полученный осадок представляет собой смесь ДНК и РНК. Его оставляют в специальном буферном растворе, включающем ЭДТА. Наличие этилендиаминтетрауксусной кислоты требуется для предотвращения разрушения ДНК клеточными нуклеазами, которые лишаются необходимых для своей работы катионов магния.

Если стоит задача получения чистой ДНК без примесей РНК, от последней избавляются с помощью РНКазы. Однако присутствие РНК не влияет на ферментативное разделение цепочек ДНК (рестрикцию), а также на ход и результаты полимеразной цепной реакции, поэтому в ряде случаев в удалении из осадка молекул рибонуклеиновой кислоты нет необходимости.

Как уже говорилось выше, стандартным способом количественной и качественной оценки полученных образцов является электрофорез в агарозном геле. При этом применяется визуальное сравнение со стандартными образцами с известной концентрацией. Если стоит задача получения более точных характеристик выделенной ДНК, проводят спектрофотометрию.

Вернуться к списку