Получение компетентных «кальциевых» клеток кишечной палочки в лабораторных условиях

Один из наиболее распространенных способов получения клеток E.coli для последующей трансформации с очищенной ДНК – инкубация бактерий при низкой температуре в жидкой среде, содержащей катионы Ca. Данная методика была разработана японскими специалистами в области генной инженерии в 1996 году. Метод включает несколько последовательных этапов.

Выращивание колоний E.coli в агаризированной среде SOB

Колонии выращиваются в чашках Петри, заполненных агаризированной SOB, куда биоматериал рассеивается методом «штриха».

Мягкие и твердые стерильные одноразовые микробиологические петли из полистирола производства итальянской компании Promed выпускаются объемом 1 и 10 мкл

Для этого в стерильных условиях в пробирку с культурой E.coli вводится простерилизованная многоразовая или стерильная одноразовая бактериологическая петля, с помощью которой осуществляется забор материала, перенос его на селективную питательную среду и распределение по ее поверхности зигзагообразным движением. Выращивать колонии в чашках Петри можно при 37°C или при 18°C. В первом случае материал для дальнейшей работы будет готов уже на следующее утро, однако уровень компетентности выращенных таким образом бактериальных клеток получится умеренным. Для получения клеток с более высокой компетентностью материал рекомендуется инкубировать при t 18°C, однако нужно учитывать, что в таком температурном режиме нужной плотности колонии достигнут лишь через несколько суток.

Глубинное культивирование и охлаждение

После инкубирования 10-12 колоний диаметром от 2 до 3 мм отбираются в колбу емкостью 0,5-1л с 40 мл жидкой среды SOB. Колба помещается на качалку, установленную в термостат, где при температуре 37°C и интенсивном встряхивании (200-300 об/мин) осуществляется глубинное культивирование культуры в течение 2-2,5 часов до достижения оптической плотности 0,6.

После этого сосуд с материалом ставят в мелко-колотый лед, где и производятся все дальнейшие манипуляции.

Центрифугирование и ресуспензирование

Охлаждение после культивирования осуществляется в течение 30 минут, после чего из колбы отбирают 30 мл культуры и центрифугируют материал в пробирке емкостью 50 мл при температуре 4°C в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин.

Затем супернатант сливают и центрифугируют бактериальные клетки в течение 20 секунд при аналогичных указанным выше скорости и температуре. После этого жидкую фракцию удаляют пипеткой, а осадок суспензируют в 10 мл буфера ТВ и оставляют на 10-15 минут в мелко-колотом льду (t - 0°C).

Диметилсульфоксид используется при выращивании компетентных клеток E.coli в качестве криопротектора

Вслед за этим материал вновь подвергается двукратному центрифугированию вышеописанными способами. Выпавшие в осадок клетки ресуспензируются в 2 мл буфера. Затем к культуре добавляется диметилсульфоксид (криопротектор) до достижения концентрации 3,5%, и сосуд выдерживается при 0°C в течение 10-15 минут. Вслед за этим культура вновь центрифугируется при 4°C и скорости 3000 об/мин в течение 10 минут, после чего супернатант сливается.

Разлив и хранение

Готовая культура разливается в охлажденные стерильные микропробирки по 100 мкл. Оптимальный вариант – трансформация компетентных клеток с очищенной ДНК непосредственно после их приготовления. При необходимости допускается хранение компетентных «кальциевых клеток» в холодильнике в течение 1-2 дней. Однако если культура приготавливается впрок, то сохранить клетки в надлежащем состоянии можно лишь путем заморозки в жидком азоте с последующим хранением при -70°C, иначе они быстро утратят компетентность.

Выбор оборудования и материалов

Встряхиватель KS 130 kontrol nol марки IKA может работать при температурах от 5 до 50 градусов Цельсия

Выбрать устройство для встряхивания не составляет проблемы – рынок современных лабораторных шейкеров и качалок представлен широким перечнем высокотехнологичных приборов, среди которых можно без труда подобрать аппарат с оптимальными характеристиками. Для центрифугирования идеальным решением по сочетанию цены, функциональности и эксплуатационных характеристик станет выбор в пользу оборудования британской марки Centurion Scientific. Главное преимущество рефрижераторных моделей этой марки – использование уникальной запатентованной технологии принудительного охлаждения, обеспечивающей исключительную точность и стабильность температуры по всему объему центрифужной камеры.

Под этой маркой выпускаются лабораторные центрифуги со сменными роторами, работающие в различных диапазонах скоростей и предназначенные для решения разных задач.

Универсальная центрифуга PrO-Hospital HLR идеально справится с подготовкой E.coli для последующей трансформации и позволит успешно решать другие задачи

Если работу с материалом планируется вести по стандартным методикам, вполне достаточным может оказаться функционал охлаждаемых универсальных центрифуг для клинических исследований с 10 ячейками встроенной памяти. Эти приборы относятся к серии Pro-Hospital. Такие же модели, как, например, цитоцентрифуга Pro-CYTLCD или ее более простая модификация Pro-CYTLED, а также центрифуги для разделения крови серии Pro-PRP разработаны с целью подготовки образцов для гистологического анализа методом жидкостной цитологии и получения богатой тромбоцитами плазмы соответственно. Они совместимы с определенными типами роторов, оснащаются предустановленными программами центрифугирования в строго определенных режимах и работают при комнатных температурах. Поэтому при выборе оборудования для работы с клеточными культурами следует обращать внимание именно на аппараты линейки Pro-Hospital с подходящим функционалом – HLR или LLR.

Для нужд научно-исследовательских лабораторий великолепно приспособлены аппараты серии Pro-Research с сенсорной панелью управления, максимально гибкой настройкой и большим объемом встроенной памяти, позволяющей одномоментно хранить и быстро запускать до 108 методик с различными параметрами.

Крайне важно использовать высококачественные среды и реактивы – это на порядок повышает продуктивность и сводит к минимуму риск порчи биоматериала. Один из лидеров в этой нише рынка – французская компания Biochem, в перечень продукции которой входят стандартные растворы, готовые буферы и среды, а также реактивы для их приготовления.

Вернуться к списку