Выделение из бактериальных клеток плазмидной и фаговой ДНК с помощью щелочного лизиса

Векторную ДНК для нужд белковой, клеточной и генетической инженерии, генной терапии и инженерной энзимологии получают из плазмид либо репликативных форм вирусов, которыми заражены бактериальные клетки. Эти двухцепочечные молекулы ДНК имеют форму ковалентно замкнутого кольца и способны к самовоспроизводству в клетке организма-хозяина.

Для того чтобы использовать внехромосомный генетический материал самой бактерии или репликативные фаги в качестве переносчиков, их необходимо отделить от высокомолекулярной хромосомной ДНК.

Хромосомные и плазмидные ДНК бактериальных клеток различаются по размерам и форме

Выделение внехромосомных ДНК по методу Бирнбойма-Доли Метод выделения фаговой и плазмидной ДНК из бактериальных клеток с помощью щелочного лизиса (Бирнбойма-Доли) был разработан еще во второй половине прошлого века, и до сих пор используется в различных модификациях как наиболее простой и эффективный.

Для разрушения клеточной стенки, при необходимости, применяется лизоцим, для лизиса мембраны клетки-хозяина – детергент SDS при pH среды 12,5. В этих условиях происходит фрагментация хромосомной ДНК, сопровождающаяся необратимой денатурацией, в то время как денатурированные молекулы плазмид не фрагментируются, и после понижения pH до 5 ренатурируют между собой.

Под действием щелочи происходит необратимая денатурация молекул хромосомной ДНК

В процессе обработки денатурированые фрагменты хромосомной ДНК регибридизируются случайным образом с выпадением высокомолекулярного творожистого осадка. Этот осадок легко отделяется с помощью центрифугирования от плазмидной или фаговой ДНК (фагмиды), остающейся в растворе, из которого ее потом осаждают этанолом или изопропанолом.

Этанолом обычно пользуются при работе с микрообъемами биоматериала. Изопропанол рекомендуется использовать при работе с большими объемами в целях экономии, так как для высаживания ДНК этот реактив требуется в гораздо меньших объемах, чем этиловый спирт.

После осаждения в спирте плазмиды или фагмиды необходимо отделить от белков. Делается это с помощью фенольных соединений или ацетата аммония. Помимо депротеинизации, может потребоваться освобождение полученных образцов от примесей РНК. Для этих целей применяют специальный фермент – РНК-азу.

Материалы и оборудование

Для работы требуется термостатируемый роторный шейкер-качалка, лабораторная центрифуга и штаммы кишечной палочки, трансформированные плазмидой и фагмидой.

Культивирование осуществляется в питательной среде с подходящим составом, например 2YT. Ресуспензирование осадка проводят в растворе, содержащем глюкозу, буфер Tris–HCl, ЭДТА и лизоцим, который по мере необходимости добавляется непосредственно перед использованием. Лизис бактерий и щелочная денатурация ДНК осуществляется с помощью свежеприготовленного раствора гидроксида натрия, смешиваемого с SDS (додецилсульфат натрия). При получении плазмид также используют ацетат калия, растворенный в смеси воды и ледяной уксусной кислоты.

Кроме того, в процессе выделения векторной ДНК пользуются смесями фенола и хлороформа, хлороформа и изоамилового спирта, водным раствором ампициллина. При работе с большим количеством материала вместо фенольных смесей обычно применяется менее токсичный ацетат аммония, который также позволяет существенно сократить объем центрифугируемого образца.

Орбитальный шейкер GFL 315 с аналоговым управлением подходит для культивирования клеточных культур в сосудах различного объема

Для культивирования бактериальной культуры необходим шейкер-встряхиватель, выдерживающий термостатирование и способный работать со скоростью 200-300 об/мин. Приборы этого типа производства немецкой компании GFL отличаются исключительной надежностью, эргономичностью и предельно простым управлением. Один из наиболее удачных вариантов для оснащения лаборатории молекулярной биологии – орбитальный шейкер GFL 315. Модель позволяет одновременно обрабатывать до 15 кг образцов, отличается компактными размерами, низким уровнем шума, плавным запуском и стабильной скоростью, в том числе – при максимальной загрузке.

При покупке центрифуги важно обратить внимание на возможность выбора оптимального режима разгона и торможения, а также предельно точное соответствие скорости и температуры требованиям технологии. Среди имеющихся на рынке лабораторных центрифуг по этим и иным параметрам лидируют устройства нескольких немецких производителей и британской компании Centurion Scientific, при этом последние отличаются более приемлемой ценой.

Функционал универсальной медицинской центрифуги PrO-Hospital LLR  позволяет успешно использовать эту модель для получения векторных ДНК

Современные лабораторные центрифуги высокой производительности марки Centurion позволяют быстро и просто выделить плазмидную ДНК из бактериальных клеток, получив генетический материал высокого качества. Для этих целей подходят как аппараты исследовательского класса, так и большинство моделей для клинических исследований, за исключением узкоспециализированных, например цитоцентрифуги с сенсорным ЖК-дисплеем или ее более дешевой модификации с LED-дисплеем. Оптимальный вариант – приобретение аппарата, работающего в широком диапазоне скоростей с роторами различного типа и объема, например Pro-Hospital LLR. Центрифуга этой модели одинаково успешно может быть использована как для получения небольших объемов, так и для выделения значительных количеств векторной ДНК.

Качественные реактивы и среды для нужд молекулярной биологии выпускает французская компания Biochem Chemopharma. В том числе, здесь производится:

• высокочистый SDS (фармакопейное качество), фасуемый в упаковки по 500 мг;
• дикалиевая соль (ЭДТА);
• глюкоза и др.

Широкий выбор готовых питательных сред с подтвержденным качеством производит итальянская компания GVS. Использование таких субстратов позволяет интенсифицировать процесс приготовления проб, одновременно сводя к минимуму риск перекрестного загрязнения.

О чем нужно помнить при выделении плазмид и фагмид с помощью щелочного лизиса

В бутылках из фторопласта производства немецкой компании Vitlab можно хранить растворы щелочей без потери свойств

Если необходимо сохранить раствор гидроксида натрия и додецилсульфата натрия для последующего применения, требуется перелить его в пластиковую емкость соответствующего объема с плотно завинчивающейся крышкой. Иначе содержащийся в воздухе углекислый газ нейтрализует щелочь. В любом случае, срок хранения готового раствора не превышает нескольких недель.

• После ресуспензирования осадка в растворе с лизоцимом необходимо выдержать образец при комнатной температуре в течение 5 минут, так при низких температурах фермент не работает. В тех случаях, когда в добавлении лизоцима нет необходимости, можно сразу добавлять щелочную среду, встряхивать содержимое и помещать емкость с образцом на лед.
• После добавления раствора ацетата калия с ледяной уксусной кислотой для предупреждения повторной фрагментации геномной ДНК приблизительно в течение 1 минуты необходимо перемешивать содержимое плавными движениями. Этого времени достаточно для полной ассоциации хромосомной ДНК в выпадающие в осадок цепочки, после чего интенсивность встряхивания следует увеличить.

Вернуться к списку