Химическая трансформация бактерий

При разработке новых лекарственных препаратов и методов борьбы с различными заболеваниями часто требуется использование микроорганизмов с заданными свойствами.

Бактерия E.coil

Для их получения, в частности, применяется метод химической трансформации бактерий, при котором производится внедрение в их генетический аппарат фрагмента чужеродного ДНК. Современная технология проведения данной процедуры включает два этапа: получение компетентных клеток и собственно трансформацию. Первая стадия необходима для формирования бактерий, восприимчивых к посторонней ДНК. На второй создаются условия для проникновения выделенного фрагмента внутрь оболочки и образования модифицированного микроорганизма. Технология рассматривается на примере обработки клеток бактерии E.coli.

Получение компетентных клеток

Вначале бактерии рассеиваются в чашку на агаризованную среду SOB (0,5% дрожжевой экстракт, 2% триптон, 2,5мМ KCl, 10мМ MgSO4, 10мМ NaCl, 10мМ MgCl2). Культура выдерживается в течение ночи при температуре 37°С. Из образовавшихся колоний бактерии отбирают 10-12 шт, диаметром 2-3мм и помещают в колбу емкостью 0,5-1,0л, куда наливают 40мл SOB. Емкость помещают в качалку, устанавливают скорость вращения 200-300 об/мин и при интенсивном встряхивании выращивают культуру при 37°С, пока оптическая плотность субстанции не достигнет OD600 = 0,6. В среднем для этого нужно 2-2,5ч.

Дальнейшие операции с бактериями проводятся на льду, для поддержания температуры на уровне 0°С. 30 мл субстанции отбирается в 50мл пробирку и выдерживается в течение 10-15 мин, после чего емкость помещается в универсальную медицинскую центрифугу. Сепарация производится на скорости 3000 об/мин при температуре до +4°С в течение 10 минут. Образовавшийся супернатант сливается, после чего центрифугирование повторяется при тех же параметрах в течение 20 секунд. Выделившаяся жидкость удаляется при помощи пипетки.

Полученный осадок смешивается с раствором, состоящим из 10мМ HEPES, 15мМ CaCl2, 55мМ MnCl2, 250мМ KCl (буфер ТВ) до образования суспензии и вновь выдерживается 10-15 минут на льду. Далее пробирка помещается в исследовательскую микроцентрифугу и повторяется процедура сепарирования: 10 минут при 3000 об/мин и t° +4C со слитием супернатанта и затем еще 20 секунд.

Микроцентрифуга K1015

После удаления остатков жидкости пипеткой к осадку добавляется 2 мл буфера ТВ, взбалтывается, после чего добавляется 70 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для получения 3,5% раствора. Пробирка выдерживается 10-15 минут на льду. Затем проводится процедура центрифугирования при 3000 об/мин, температуре +4°С в течение 10 минут. После слива супернатанта остаток взбалтывается до суспензии и разливается по 100мкл в охлажденные пробирки емкостью 1,7мл. Полученные «кальциевые клетки» используются сразу или замораживаются в жидком азоте.

Трансформация

Водяная баня WNE 7

Трансформация компетентных клеток начинается с приготовления раствора плазмидной ДНК pBR322. Его концентрация должна составлять 5нг/мл. Для получения необходимых параметров к одному микролитру базового раствора с концентрацией 0,5 мкг/мл, добавляется 100 микролитров деионизированной воды. Затем на льду производится разморозка 4 мкл 0,5M β-меркаптоэтанола и 100 микролитров компетентных (кальциевых) клеток. Все ингредиенты смешиваются в пробирке и выдерживаются на льду в течение 20-30 минут. В это время происходит осаждение посторонней ДНК на внешней поверхности клеток E.coli.

По истечении указанного срока пробирку помещают на 30 секунд в микротермостат или на водяную баню с температурой 42°С. Из-за термического воздействия повышается текучесть клеточной мембраны и ДНК проникает внутрь бактерии. Для завершения процедуры колба с раствором вновь помещается в лед на 1-2 минуты. Это позволяет восстановить текучесть мембраны и «запечатать» ДНК внутри клетки.

Шейкер-инкубатор KS 4000

Приготавливается питательная среда SOC, состоящая из 0,5% дрожжевого экстракта, 2% триптона, 2,5мМ KCl, 10мМ MgSO4, 10мМ NaCl, 10мМ MgCl2 с добавлением 5мл 20% глюкозы на каждые 100мл среды SOB. 400мл полученного раствора смешивается в пробирке с обработанной культурой бактерии E.coli и помещается в шейкер, где встряхивается при температуре 37°С в течение 30 минут.

Из полученной суспензии отбирается аликвота 50 микролитров и высеивается на чашку с агаром 2YT, который содержит ампициллин б в концентрации 100 мкг/мл. В такой среде способность к росту сохраняют только клетки, успешно прошедшие трансформацию. Эффективность процедуры оценивается в течение следующих суток или двух. Для этого подсчитывается количество колоний, хорошо различимых на чашке Петри.

Каждое из таких образований содержит порядка 104-105 клеток. Если исследователь насчитывает N колоний, то эффективность трансформации составляет N x 10⁶ на 1 микрограмм ДНКв.

Вернуться к списку