Разделение белков методом капиллярного гель-электрофореза

Получение белковых фракций с помощью гель-электрофореза входит в перечень манипуляций, выполняемых в лабораториях генетического, биохимического и молекулярного профиля. Зная электрофоретическую подвижность различных белков и пептидов, специалисты выбирают оптимальный способ обработки пробы. Для экстрагирования белков из гомогената тканей чаще всего используют полиакриламидные гели и буферные растворы с додецилсульфатом натрия (SDS) (метод Леммли).

Центрифугирование – один из этапов пробоподготовки

Взвешенный в буфере гомогенат центрифугируют. Для этих целей идеально приспособлены настольные центрифуги с роторами, поддерживающими работу на скорости 10000 об/мин и выше, производства британской компании «Centurion Scientific».

Исследовательская центрифуга Centurion K1015 идеально приспособлена для обработки гомогенатов тканей

В перечень выпускаемых под данной маркой приборов входят как универсальные аппараты, способные работать в широком диапазоне скоростей с роторами различного типа и назначения, так и модели, адаптированные для решения узкого спектра задач – микроцентрифуги с роторами для ПЦР-стрипов, микропробирок и пробирок объемом 15 мл, цитоцентрифуги и т.д.

Лучшими возможностями для подготовки проб с денатурированными белками из гомогенатов биологических тканей обладают центрифуги Centurion исследовательского класса, так как в моделях этой серии можно максимально гибко настраивать параметры и поддерживать стабильную температуру по всему объему центрифужной камеры в строгом соответствии с требованиями методики.

После окончания центрифугирования из пробирок отбирают супернатант, содержащий смесь различных белковых молекул. Их разделение происходит тонких стеклянных сосудах – капиллярах, которые заполняются гелем с требуемым размером пор, выполняющим роль так называемого «молекулярного сита». Мелкие компоненты белковой смеси проходят через такое «сито» быстрее, чем крупные, что позволяет исследователям разделить макромолекулы белка по их молекулярной массе.

Типы и особенности гелей для капиллярного электрофореза

Для гель-электрофореза могут использоваться химически и динамически модифицированными гелями. Химически модифицированный полиакриламидный гель получают полимеризацией акриламида прямо внутри капилляра. Такой полиакриламид называется поперечно сшитым. Обычно он прочно связывается с кварцевой внутренней поверхностью капилляра и не может быть удален из сосуда без разрушения последнего. Аналогичными характеристиками обладает поливинилпирролидон (поли-N-винилбутиролактам). Любые химически модифицированные гели неподвижны, поэтому в заполненные ими капилляры пробы вводят только электрокинетическим методом.

Ацетонитрил – модификатор буферного раствора, позволяющий регулировать пористость поперечно-сшитого геля

Оптимизировать процесс разделения белков в поперечно-сшитом геле можно с помощью регулирования его пористости в процессе приготовления и модификации буферного раствора. Буфер модифицируют путем добавления ацетонитрила, метанола и других органических веществ. Это позволяет увеличить растворимость пробы, влияет на степень ионизации молекул в образце и приводит к уменьшению электроосмотических потоков. Если исследователям необходимо разделить оптические изомеры, в буфер добавляют полисахариды, белки или иные хиральные модификаторы. Пористость регулируется посредством изменения количества полимеризируемого вещества и его процентного соотношения со сшивающим агентом.

Динамически модифицированные гели относятся к гидрофильным полимерам. Их получают на основе производных целлюлозы, линейного полиакриламида, декстрана и других веществ, пригодных для растворения в буферах на водной основе. В результате смешивания гидрофильных полимеров с буферами образуется разделяющая среда. Динамически модифицированные гели подвижны, поэтому их можно вводить в капилляры под давлением. Для улучшения воспроизводимости результатов электрофоретического разделения желательно заменять динамически модифицированный гель перед каждым введением пробы.

Схема миграции белковых молекул в капилляре

Для увеличения пористости таких гелей с буферами смешивают полимеры с большой молекулярной массой либо уменьшают концентрацию полимера в водном растворе. Чем меньше пористость динамически модифицированного геля, тем менее подвижны его компоненты. Поскольку вязкость таких растворов низкая, пробы в них можно вводить как электрокинетическим, так и гидродинамическим способом.

Современное оборудование для капиллярного электрофореза

Инновационные высокотехнологичные системы для капиллярного электрофореза позволяют быстро и эффективно провести разделение белковых смесей, выделенных из гомогенатов исследуемых тканей. Выпуском таких приборов занимается отечественное предприятие «Люмекс».

Последнее поколение оборудования российского производства представлено моделями КАПЕЛЬ-104Т, КАПЕЛЬ-105/105M и КАПЕЛЬ®-205.

Капель 104Т – система для капиллярного электрофореза с кремниевым фотодиодом

КАПЕЛЬ-104Т – бюджетный вариант для капиллярного электрофореза. Возможностей прибора с избытком хватает для решения любых рутинных задач. Модель оборудована ртутной лампой низкого давления, технические характеристики которой обеспечивают повышенную стабильность светового потока. Кремниевый фотометрический детектор работает в монохроматическом режиме, за счет чего обеспечивается расширение диапазона определяемых концентраций и повышенная чувствительность системы.

Модель КАПЕЛЬ-105 построена на дейтериевой лампе и оснащена спектрофотометрическим детектором, благодаря чему специалист может менять длины волн детектирования, выбирая оптимальные параметры для анализируемых образцов.

В модификации КАПЕЛЬ-105M прибор получает дополнительное программное обеспечение для обработки полученных результатов, а также кассету особой конструкции, позволяющей быстро и просто менять капилляр.

Одно из главных отличий и основных преимуществ система капиллярного электрофореза КАПЕЛЬ®-205 – увеличенная производительность за счет комплектации устройством для автоматического ввода образцов, рассчитанным на загрузку 59 пробирок. Поддержка функции автоматического открытия и закрытия крышек сосудов с пробами исключает испарение и загрязнение последних. Автоматическая промывка капилляров под давлением позволяет использовать модель для работы с фоновыми электролитами высокой вязкости.

Вернуться к списку